Leishmania spp., Plasmodium spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincirleme Tepkimesi ile Tanısı: Limit Saptama Pilot Çalışması

Abstract

Amaç: Kan ve dokularda yerleşen paraziter hastalıklar insan sağlığı için dünya çapında büyük tehlike oluşturmaktadır. Sıtma, leishmaniasis ve toksoplazmoz her yıl çok sayıda kişinin yaşamını kaybetmesine neden olmakta, tedavi maliyetleri ve iş gücü kaybı nedeniyle ülke ekonomilerine büyük yük getirmektedir. Bu çalışmada, Plasmodium spp., Leishmania spp. ve Toxoplasma gondii’nin Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (GZ-PZR) ile klinik örneğin mikrolitresinde belirlenebilecek en düşük parazit sayısının belirlenmesi, test validasyonlarının yapılması ve GZ-PZR testinin rutin laboratuvarlara dâhil edilmesi amaçlanmıştır. Yöntem: Leishmania tropica (promastigot ve amastigot), L. infantum (promastigot ve amastigot), T. gondii Thoma lamı ile mikroskop altında sayılarak P. falciparum ve P. vivax ise yayma preparatlar hazırlanıp Giemsa ile boyandıktan sonra mikroskop altında incelenerek parazitemi yoğunluğu saptanmıştır. Daha sonra bu parazitlerin PBS solüsyonu ile mikrolitrede 1, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1.000, 2.500, 5.000 ve 10.000 parazit olacak şekilde dilüsyonları yapılmıştır. Tüm parazit süspansiyonlarından DNA izolasyonu yapılarak GZ-PZR ile pozitif sonuç alınan en düşük parazit süspansiyonu belirlenmiştir. Daha sonra da negatif sonuç alınan süspansiyon ile bir önceki pozitif süspansiyon arası yine dilüsyon yapılarak testin saptayabildiği en düşük parazit sayısı belirlenmiştir. Bulgular: GZ-PZR testinde P. falciparum ile L. tropica ve L. infantum’un promastigot ve amastigot formlarında en düşük parazit sayısı 10, P. vivax ve T. gondii parazitlerinde ise 12 olarak bulunmuştur. Tartışma: Leishmania spp., Plasmodium spp. ve T. gondii’nin GZ-PZR ile tanısında çok düşük sayıdaki parazitlerin başarı ile saptanması, bu testin her üç parazitin moleküler tanısında güvenle kullanılabileceğini düşündürmüştür.

Objective: Parasitic diseases that involve blood and tissues pose a significant threat to human health worldwide. Malaria, leishmaniasis and toxoplasmosis kill thousands of people worldwide annually, and impose a great burden on national economies due to treatment costs and loss of labour. The aim of this study are to determine the lowest number of parasites detectable by Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) for Plasmodium spp., Leishmania spp. and T. gondii and to validate the RT-PCR test, and integrate RT-PCR in routine laboratories applications. Methods: Leishmania tropica (both promastigotes and amastigotes), L. infantum (both promastigotes and amastigotes) and T. gondii were counted using a hemocytometer, while Giemsa-stained smears of P. falciparum and P. vivax were examined under the microscope to define their parasitic load. Then, dilutions as 1, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1.000, 2.500, 5.000 and 10.000 parasites/ul were prepared in PBS solutions. DNA isolation was performed from all parasite suspensions and the lowest parasite suspension which was positively detected by RT-PCR method was identified. This was followed by further dilutions between the previous negative and last positive dilutions, to further determine the lowest number of parasites that RT-PCR could eventually identify. Results: Our assessments showed that the lowest number of parasites necessary for positive RT-PCR were 10 for P. falciparum and amastigotes and promastigote forms of L. tropica/L. infantum, while 12 for P. vivax and T. gondii. Conclusion: These results show that RT-PCR is a reliable diagnostic option to be used successfully for the detection of Leishmania spp., Plasmodium spp. and T. gondii, even for infections with low parasitemia.